前言

Santiago Ramón y Cajal（1852-1934）和Camillo Golgi（1843-1926）开创了现代神经科学的先河。
Sydney Brenner（1927-2019）证明了电子显微镜技术用于微观连接组学研究的可行性。

连接组学

神经系统是高等生命体的重要组成部分，负责感知内外环境刺激，并对各种刺激进行编码和传输，最终协调其他系统共同对当前状态做出适当的反应。 高度复杂的神经系统构成了生物智能的物理基础，其神经元的连接模式是区分不同物种或者相同物种不同个体的一项重要指标1。 西班牙神经解剖学家Santiago Ramón y Cajal（1852-1934）通过Camillo Golgi（1843-1926）发明的银染色技术（高尔基法），对神经系统的结构进行了精确地观察和描述，从而开创了现代神经科学的先河2。 当前科学技术的发展使得我们有机会在更大尺度和更高精度下观察神经经系统，进而能够更加系统地绘制神经系统的连接图谱，这即是连接组学（Connectomics）领域的研究目的。 根据研究尺度的差异，我们通常可以将连接组学划分为宏观（Marco-connectomics，毫米尺度）、介观（Meso-connectomics，微米尺度）和微观（Micro-connectomics，纳米尺度）三个层次。 有关三者的异同已经有非常详尽的描述3456，本文即将讨论的是三者中成像分辨率最高的微观连接组学（如不特别指出，本文“连接组学”均特指“微观连接组学”）。

图片取自Sophie H Bennett et al., Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 2018.图3

微观连接组学

微观连接组学旨在从纳米尺度，即亚细胞尺度观察并绘制神经元之间的连接图谱，由问题定义，样品制备，图像采集，图像处理，数据分析五个关键部分组成（见图1)，是一项兼具科学和技术挑战的跨学科科研工程，在现代神经科学研究中有重要的价值7。 历史上，电子显微镜技术（Electron Microscopy）因其出色的分辨率很早就被应用于神经科学研究8，研究人员通过电镜能够在纳米级分辨率下观察观察神经系统的超微结构，例如轴突（Axon）、树突（Dendrite）、突触连接（Synapse）以及其他细胞器。 上世纪八十年代，Sydney Brenner（1927-2019）极具先锋精神地发布了线虫（Caenorhabditis elegans）的神经系统连接图谱9。 这是人类首次实现完整神经系统的重构，不仅开创了线虫研究领域10，也证实了电子显微镜技术用于微观连接组学研究的可行性11。

图1. 连接组学研究的主要环节以及涉及的学科和技术

成像技术进展

图像采集效率不高是制约早期连接组学发展的主要瓶颈之一。 随着成像工业的发展，在研究人员的智慧和努力之下，近几十年出现了一系列新型成像技术和流程（见图2），显著地提高了图像采集效率，推动了连接组学的快速发展。 这些成像技术被统称为体式显微镜技术（volume electon microscopy, vEM）12，按照成像设备可以将其归纳为透射成像和扫描成像两种，分别使用透射显微镜（Transmission electron microscope，TEM）和扫描显微镜（Scanning electron microscope，SEM）进行成像。

图2. 连接组学成像技术示意图

透射成像方式中的连续切片成像技术（serial section TEM， ssTEM）13继承了传统连接组学高分辨率的优势，借助电子化的成像介质、电动位移台、成像控制软件14等，实现了采集过程的自动化，大幅提升了图像采集效率。 在此基础上通过改造成像室，用高速CCD相机阵列（TEM camera array，TEMCA）1516替换传统相机，图像采集效率进一步获得了提升。 最新的并行自动透射成像技术（parallel imaging using Transmission Electron Automate Microscopy，piTEAM）17通过多台高通量自动化透射电子显微镜（autoTEM）组成的分布式成像平台将透射成像的峰值采样效率提高到3Gpixel/s。

在扫描成像技术中，通过胶带收集连续切片装置（automated tape-collecting ultramicrotome，ATUM）1819实现了切片采集的自动化，在提升制样效率的同时也保证切片的稳定性和精度，从而提高了Z方向的分辨率。多束扫描电镜（Multi-Beam SEM）20采用多束电子束同时成像，不仅成倍地提升了扫描成像效率，还扩大了扫描成像可采集的样品尺寸。 块面扫描技术利用钻石刀（serial block-face SEM，SBSEM）21或者聚焦离子束（focused ion beam SEM，FIBSEM）22，开创性地将切片和成像过程在真空仓内融合，进一步地提高了Z轴的分辨率。

新型成像方法在数据通量、自动化程度、Z轴分辨率等方面存在诸多优势，但是对于传统的神经科学社区研究人员来说，应用这些先进的成像技术代表着更高的设备成本，一些尚未商业化的定制改造更是存在着较高的技术壁垒。 相比之下，ssTEM无需任何硬件升级，在各项技术中最大程度地沿用了传统生物电镜的技术方案23，仍然是目前连接组学领域使用最广泛的成像技术24，同时也是广大生物电镜研究社区加入连接组学研究最实际的选择。

图像处理工具现状

图像采集完成了样本信息的电子化过程，得到的每一张图像都包含了样本的一小部分信息，未经处理无法被连接组学研究直接使用。 而图像处理阶段的主要任务就是将原始图像转化成为可被研究人员直接分析和使用的数据类型。 针对不同的成像技术，图像处理阶段的具体操作存在些许差异25，但是归根结底的处理思路是一致的（见图3）：首先是图像重构，即通过图像匹配和图像融合技术将采集到的电镜图象重构成为三维空间内连续的形式，尽可能真实地还原连接组学样本的完整信息；其次是形态重构，即通过图像分割或图像标注将三维图像中的信息像划分为不同的神经系统成分，从而完成从图像到可分析数据的过程。

图3. 连接组学一般处理流程

当样本规模较小时，研究人员可以利用一些通用的图像编辑软件，通过手动处理即可完成图像处理过程。 而伴随图像采集效率的提高，近些年来连接组学的研究规模不断扩大，在短时间内累积了大量的原始数据，如何高效高质量地处理这些数据就成为目前连接组学研究亟待解决的难题262724。 很显然，这种情况下传统的手工处理方式已经不再现实，唯有辅以更加专业的图像处理工具，才能在有限时间内完成图像处理过程。

为此，不同的研究组根据各自的研究目的和技术能力开发了众多可用于图像处理的工具软件，但是截至目前连接组学领域内尚未形成一套统一的图像处理解决方案。 这种处理工具的不一致性给试图进入连接组学领域的人员在工具选择时造成了不便。 除此以外，开发人员和社区用户之间往往存在一些天然的信息不对称28。开发者倾向于关注工具的技术细节，导致技术资料或文章内容更侧重方法本身，忽略了社区用户更加关注的应用层面的描述。 许多商用软件（表1）在技术手册和用户友好性方面做了许多优化，但需要支付不菲的价格。 因此系统性地梳理当前连接组学图像处理过程中的开源软件，有助于研究人员更有效地选择图像处理工具，因而能够吸引更多的研究人员加入连接组学研究。

表1. 常用商业图像处理软件

工具 公司 参考
Amira ThermoFisher https://www.thermofisher.com/ca/en/home/electron-microscopy/products/software-em-3d-vis/amira-software.html
Arivis Vision4D ZEISS https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/arivis-vision4d.html
Atlas V ZEISS https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/atlas.html
Aivia Leica https://www.aivia-software.com/
DigitMicrograph Gatan https://www.gatan.com/products/tem-analysis/gatan-microscopy-suite-software
Imaris OXFORD instrument https://imaris.oxinst.com/
Neurolucida MBF Bioscience https://www.mbfbioscience.com/neurolucida

本文结构

本文从电镜连接组学图像处理的通用流程出发，按顺序对处理流程中的关键环节以及可开放获取工具进行介绍，重点关注工具的实用性和适用范围并避免过多的原理剖析。其中，

  • 第二章聚焦图像重构过程，即从采集原始图像出发重构样品的三维结构；
  • 第三章介绍形态重构注环节，即在三维图像中标注神经系统的结构信息；
  • 第四章列举数据分析方式，即对重构好的数据进一步的理解和应用；
  • 第五章讨论了在连接组学实际工作中依然面临的挑战。

我们在本文基础上提供了一个在线版本，不定期地进行内容维护和扩充，以便能够弥补本文的不足，最终全面地涵盖连接组学图像处理的每个环节以及相关工具，我们非常欢迎读者能在此过程中提供宝贵的意见和建议。

  1. Sebastian Seung. Connectome: How the brain's wiring makes us who we are. HMH, 2012. ↩

  2. Javier DeFelipe. Sesquicentenary of the birthday of santiago ramón y cajal, the father of modern neuroscience. TRENDS in Neurosciences, 25(9):481–484, 2002. ↩

  3. Le SUN and JiuLin DU. Progress in brain neural connectomics. Scientia Sinica Vitae, 48(3):253–265, 2018. ↩

  4. Larry W Swanson and Jeff W Lichtman. From cajal to connectome and beyond. Annual review of neuroscience, 39:197–216, 2016. ↩

  5. Henry Kennedy, David C Van Essen, and Yves Christen. Micro-, meso-and macro-connectomics of the brain. Springer Nature, 2016. ↩

  6. Sophie H Bennett, Alastair J Kirby, and Gerald T Finnerty. Rewiring the connectome: evidence and effects. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 88:51–62, 2018. ↩

  7. Manuel Schröter, Ole Paulsen, and Edward T Bullmore. Micro-connectomics: probing the organization of neuronal networks at the cellular scale. Nature Reviews Neuroscience, 18(3):131–146, 2017. ↩

  8. Edward G Gray. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study. Journal of anatomy, 93(Pt 4):420, 1959. ↩

  9. John G White, Eileen Southgate, J Nichol Thomson, Sydney Brenner, and others. The structure of the nervous system of the nematode caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 314(1165):1–340, 1986. ↩

  10. William R Schafer. The worm connectome: back to the future. Trends in neurosciences, 41(11):763–765, 2018. ↩

  11. Scott W Emmons. The beginning of connectomics: a commentary on white et al.(1986)‘the structure of the nervous system of the nematode caenorhabditis elegans’. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 370(1666):20140309, 2015. ↩

  12. Kevin L Briggman and Davi D Bock. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current opinion in neurobiology, 22(1):154–161, 2012. ↩

  13. James R Anderson, Bryan W Jones, Carl B Watt, Margaret V Shaw, Jia-Hui Yang, David DeMill, James S Lauritzen, Yanhua Lin, Kevin D Rapp, David Mastronarde, and others. Exploring the retinal connectome. Molecular vision, 17:355, 2011. ↩

  14. David N Mastronarde. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology, 152(1):36–51, 2005. ↩

  15. Davi D Bock, Wei-Chung Allen Lee, Aaron M Kerlin, Mark L Andermann, Greg Hood, Arthur W Wetzel, Sergey Yurgenson, Edward R Soucy, Hyon Suk Kim, and R Clay Reid. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature, 471(7337):177–182, 2011. ↩

  16. Zhihao Zheng, J Scott Lauritzen, Eric Perlman, Camenzind G Robinson, Matthew Nichols, Daniel Milkie, Omar Torrens, John Price, Corey B Fisher, Nadiya Sharifi, and others. A complete electron microscopy volume of the brain of adult drosophila melanogaster. Cell, 174(3):730–743, 2018. ↩

  17. Wenjing Yin, Derrick Brittain, Jay Borseth, Marie E Scott, Derric Williams, Jedediah Perkins, Christopher S Own, Matthew Murfitt, Russel M Torres, Daniel Kapner, and others. A petascale automated imaging pipeline for mapping neuronal circuits with high-throughput transmission electron microscopy. Nature communications, 11(1):1–12, 2020. ↩

  18. KJ Hayworth, N Kasthuri, R Schalek, and JW Lichtman. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume tem reconstructions. Microscopy and Microanalysis, 12(S02):86–87, 2006. ↩

  19. Kenneth J Hayworth, Josh L Morgan, Richard Schalek, Daniel R Berger, David GC Hildebrand, and Jeff W Lichtman. Imaging atum ultrathin section libraries with wafermapper: a multi-scale approach to em reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits, 8:68, 2014. ↩

  20. Anna Lena Eberle and Dirk Zeidler. Multi-beam scanning electron microscopy for high-throughput imaging in connectomics research. Frontiers in Neuroanatomy, pages 112, 2018. ↩

  21. Winfried Denk, Heinz Horstmann, and Kristen M Harris. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology, 2(11):e329, 2004. ↩

  22. Graham Knott, Herschel Marchman, David Wall, and Ben Lich. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience, 28(12):2959–2964, 2008. ↩

  23. Kristen M Harris, Elizabeth Perry, Jennifer Bourne, Marcia Feinberg, Linnaea Ostroff, and Jamie Hurlburt. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience, 26(47):12101–12103, 2006. ↩

  24. Jörgen Kornfeld and Winfried Denk. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current opinion in neurobiology, 50:261–267, 2018. ↩↩

  25. Moritz Helmstaedter and Partha P Mitra. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Current opinion in neurobiology, 22(1):162–169, 2012. ↩

  26. Christopher J Peddie and Lucy M Collinson. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron, 61:9–19, 2014. ↩

  27. Jeff W Lichtman, Hanspeter Pfister, and Nir Shavit. The big data challenges of connectomics. Nature neuroscience, 17(11):1448–1454, 2014. ↩

  28. Anjalie Schlaeppi, Wilson Adams, Robert Haase, Jan Huisken, Ryan B MacDonald, Kevin W Eliceiri, and Elisabeth C Kugler. Meeting in the middle: towards successful multidisciplinary bioimage analysis collaboration. Frontiers in Bioinformatics, pages 40, 2022. ↩